I. PENDAHULUAN
A. Judul
Enzim
B. Tujuan
1.
Mengetahui waktu, dan suhu optimum aktivitas
enzim amilase
2.
Melihat pH, suhu, dan suhu optimum aktivitas
enzim nitrat reduktase
3.
Melihat pH optimum enzim nitrat reduktase secara
kuantitatif
II. TINJAUAN PUSTAKA
Enzim adalah biomolekul yang berfungsi sebagai katalis
(senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu
reaksi kimia. Hampir semua enzim merupakan protein. Pada reaksi yang
dikatalisasi oleh enzim, molekul awal reaksi disebut sebagai substrat, dan
enzim mengubah molekul tersebut menjadi molekul-molekul yang berbeda, disebut
produk. Hampir semua proses biologis sel memerlukan enzim agar dapat
berlangsung dengan cukup cepat. Molekul enzim meningkatkan dengan nyata
kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa enzim akan berlangsung sangat lama.
Enzim tidak mengubah titik keseimbangan reaksi yang dikatalisisnya, enzim juga
tidak akan habis dipakai atau diubah secara permanen oleh reaksi – reaksinya
(Lehninger, 1990).
Fungsi penting dari enzim adalah sebagai biokatalisator, reaksi kimia
secara kolektif membentuk metabolisme perantara sel, suatu bagian yang sangat
kecil dari suatu molekul besar protein enzim sangat berperan untuk katalis
reaksi. Bagian yang kecil ini dinamakan bagian aktif enzim. Aktivitas katalik
enzim dapat ditentukan juga melalui struktur tiga dimensi molekul enzim
tersebut. Enzim disini mempunyai peranan katalis dalam menurunkan aktivitas
dari reaksi energi. Aktivasi dapat diartikan sebagai sejumlah energi atau kalori
yang diturunkan oleh suatu mol zat pada temperatur tertentu untuk membawa
molekul ke dalam aktifnya atau keadaan aktifnya (Wirahadikusuma, 1989).
Enzim tidak
hanya berupa protein, ada zat lain non-protein. Zat tersebut adalah kofaktor
atau kokatalis. Kofaktor dapat organik ataupun ion logam, seperti Fe++,
Mn++, Zn++, Cu++, Mg++, dan Ni++.
Kofaktor terikat kuat dengan proteinnya disebut gugus protestik, sedangkan
kofaktor yang mudah lepas dari proteinnya disebut koenzim. Agar enzim dapat
bekerja, harus ada holoenzim yang merupakan penggabungan dari bagian protein
enzim yang disebut apoenzim (feron) dan koenzim (agon) (Sumardjo, 2009).
Menurut Trenggono (1989). Secara kimiawi, enzim merupakan
senyawa protein dengan berat molekul tinggi. Menurut Trenggono (1989), suatu
katalis enzim memiliki sifat:
1.
Berperan
dalam jumlah yang sangat sedikit.
2.
Akan
muncul tetap utuh dari suatu reaksi.
3.
Berfungsi
mempercepat laju reaksi, tetapi tidak mempengaruhi keseimbangan akhir.
Menurut Trenggono (1989 ), sebagai
katalis dalam reaksi-reaksi di dalam tubuh organisme, enzim memiliki beberapa
sifat, yaitu:
1. Enzim adalah protein, karenanya enzim bersifat
thermolabil, membutuhkan pH dan suhu yang tepat.
2. Enzim
bekerja secara spesifik, dimana satu enzim hanya bekerja pada satu substrat.
3. Enzim berfungsi sebagai katalis, yaitu mempercepat
terjadinya reaksi kimia tanpa mengubah kesetimbangan reaksi.
4. Enzim hanya diperlukan dalam jumlah sedikit.
5. Enzim dapat bekerja secara bolak-balik.
6. Enzim
dipengaruhi oleh lingkungan, seperti oleh suhu, pH, konsentrasi.
Faktor-faktor yang mempengaruhi
kerja enzim menurut Poedjiadi (1994) adalah:
- Konsentrasi
enzim
Pada suatu
konsentrasi substrat tertentu, kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya
konsentrasi enzim.
- Konsentrasi
substrat
Dengan
konsentrasi enzim yang tetap, perubahan substrat akan menambah kecepatan
reaksi.
- Suhu
Kenaikan suhu
dapat menyebabkan denaturasi, sehingga bagian aktifnya terganggu, akibatnya
konsentrasi spesifik enzim berkurang dan kecepatan reaksinya turun.
- Pengaruh
pH
Struktur ion
enzim tergantung pada pH lingkungannya, enzim dapat terbentuk ion (+) atau (-)
atau bermuatan ganda (zwitter ion). pH dapat menyebabkan proses denaturasi yang
dapat mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim.
- Pengaruh
inhibitor
Dapat berupa
hambatan inversibel yang disebabkan oleh terjadinya destruksi atau modifikasi
sebuah gugus fungsi atau lebih, yang terdapat pada molekul enzim. Hambatan
reversibel dapat berupa hambatan bersaing dan tak bersaing.
Sifat-sifat enzim menurut Aryulina dkk.,(2007)
adalah sebagai berikut:
1. Enzim adalah protein
Karena
enzim adalah protein, kerja enzim seperti sifat protein, yaitu membutuhkan
kondisi lingkungan (suhu, ph, konsentrasi ion, dsb) yang sesuai. Lingkungan
enzim yang tidak cocok menyebabkan enzim rusak sehingga tidak mampu bekerja
dengan baik.
2. Enzim bekerja secara spesifik/khusus
Ada
ribuan jenis enzim yang fungsinya sangat spesifik. Tiap enzim hanya dapat
bekerja untuk mengkatalis reaksi yang spesifik. Dengan kata lain, suatu enzim
hanya dapat bekerja untuk substratnya yang cocok.
3. Enzim berfungsi sebagai katalis
Katalis
mengubah kecepatan reaksi, namun tidak mengubah produk akhir yang dibentuk atau
mempengaruhi keseimbangan reaksi.
4. Enzim hanya diperlukan dalam jumlah sedikit
Sesuai
dengan fungsinya sebagai katalis, enzim hanya diperlukan dalam jumlah sedikit.
Sejumlah kecil enzim dapat meningkatkan kecepatan reaksi secara hebat.
5. Enzim dapat bekerja secara bolak-balik
Enzim
tidak mempengaruhi arah reaksi, sehingga dapat bekerja bolak-balik. Enzim dapat
menguraikan dan menyusun suatu senyawa.
Guna membantu penelitian mengenai enzim, telah disusun suatu
klafikasi internasional yang menetapkan 6 kelas utama fungsi enzim,
masing-masing dengan beberapa subkelasnya. Menurut Montogomery (1993), berikut
ini adalah klasifikasinya:
1.
Oksireduktase:
Mengkatalisis berbagai macam reaksi oksidasi-reduksi, serta sering
mempergunakan co-enzim seperti NAD+, NADP+, FAD, atau lipoat sebagai aseptor
hydrogen.
2.
Transferase:
Mengkatalisis berbagai jenis transfer kelompok. Dalam metabolismenya banyak
langkah-langkah penting yang memerlukan transfer dari suatu molekul lain dari
kelompok amino, karboksil, metal, asil, glikosil, atau fosfosil.
3.
Hidrolase:
Mengkatalisis pembelahan ikatan antara karbon dan beberapa atom lain dengan
adanya penambahan air.
4.
Liase:
Mengkatalisis pemecahan ikatan karbon-karbon, karbon-sulfur, dan
karbon-nitrogen tertentu.
5.
Isomerase:
Mengkatalisis rasemase isomer optik dan geometrik dan reaksi-reaksi
oksidasi-reduksi intramolekul tertentu.
6.
Ligase:
Mengkatalisis pembentukan ikatan antara karbon dengan oksigen, sulfar,
nitrogen, dan atom-atom lain.
Enzim memiliki spesifikasi yang sangat sempit,
misalnya hanya mengkatalisator reaksi – reaksi dalam kisaran yang kecil atau
bahkan dalam beberapa hal hanya satu macam reaksi dalam kisaran yang kecil.
enzim juga hanya berfungsi pada kondisi – kondisi tertentu yang meliputi pH,
suhu, konsentrasi substrat, kofaktor, dan sebagainya. Hanya beberapa yang dapat
diukur secara langsung karena untuk proses katalis hanya dibutuhkan dalam kadar
yang sangat rendah, karena itu adanya enzim ditunjukkan secara tak langsung
oleh berkurangnya atau hilangnya substrat atau oleh adanya hasil reaksi. Enzim
yang memiliki sifat spesifik terhadap substrat. Spesifik enzim disebabkan oleh
sisi aktif enzim yang terdiri oleh urutan asam amino yang memiliki rantai
samping dengan gugus reaktif tertentu sehingga hanya spesifik oleh substrat
tertentu (Plamer, 1995). Dua ciri tersebut disebabkan oleh enzim yang memiliki
sisi aktif yaitu sisi yang mampu melakukan pengarahan, pengikatan katalisa yang
tidak dimiliki enzim pada umumnya (Trenggono, 1989).
Pati atau amilum adalah karbohidrat kompleks yang tidak
larut dalam air, berwujud bubuk putih, tawar dan tidak berbau. Pati merupakan
bahan utama yang dihasilkan oleh tumbuhan untuk menyimpan kelebihan glukosa
(sebagai produk fotosintesis) dalam jangka panjang. Hewan dan manusia juga
menjadikan pati sebagai sumber energi yang penting. Pati tersusun dari dua
macam karbohidrat, amilosa dan amilopektin, dalam komposisi yang berbeda-beda.
Amilosa memberikan sifat keras (pera) sedangkan amilopektin menyebabkan sifat
lengket. Amilosa memberikan warna ungu pekat pada tes iodin sedangkan amilopektin
tidak bereaksi (Winarno, 1997)
Amilase adalah
enzim cerna yang menghasilkan zat pati (amilum) menjadi molekul-molekul
karbohidrat yang lebih kecil,lokasi berfungsinya adalah di luar sel. Enzim itu
disekresikan ke dalam air liur dan ke dalam saluran cerna bagian atas dan
mendepolimer zat-zat pati dalam makanan menjadi potongan-potongan yang dapat
diserap (Widmann, 1992).
Amilase yang terkandung dalam
saliva (air ludah) akan menghidrolisa
ikatan α–1 antar unit D-Glukosa. Hidrolisa tersebut berlangsung acak (random).
Nilai pH sekitar 6 hingga 7, ion klorida menyebabkan α-amilase mengkatalisis
hidrolisa pati menghasilkan berbagai dekstrin sebagai produk akhirnya. Pati dan dekstrin BM tinggi meberikan warna
ungu untuk Iodin, kerja dari α – amilase dapat diikuti dengan mengamati waktu
yang diperlukan sampai mencapai keadaan dimana campuran reaktan tidak membentuk
warna lagi dengan Iodin, keadaan ini disebut achramic point (Trenggono,
1989).
Suasana
yang terlalu asam atau alkalis menyebabkan denaturasi protein dan hilangnya
secara total aktivitas enzim. Pada sel hidup, perubahan pH sangat kecil. Enzim
hanya aktif pada kisaran pH yang sempit. Oleh karena itu media harus
benar-benar dipelihara dengan menggunakan buffer (larutan penyangga). Jika
enzim memiliki lebih dari satu substrat, maka pH optimumnya akan berbeda pada
suatu substrat (Tranggono dan Sutardi, 1990). Tiap enzim memiliki karakteristik
pH optimal dan aktif dalam range pH yang relatif kecil, dalam banyak kasus,
bentuk kurva menandakan dari keaktifan enzim berbanding pH yang terkandung di
dalamnya (Almet dan Trevor, 1991). pH optimal enzim adalah sekitar pH 7
(netral) dan jika medium menjadi sangat asam atau sangat alkalis enzim
mengalami inaktivasi. Akan tetapi beberapa enzim hanya beroperasi dalam keadaan
asam atau alkalis. Sebagai contoh, pepsin, enzim yang dikeluarkan ke lambung,
hanya dapat berfungsi dalam kondisi asam, dengan pH optimal 2 (Gaman dan
Sherrington, 1994).
Larutan
buffer adalah larutan yang tahan terhadap perubahan pH dengan penambahan asam
atau basa. Larutan seperti itu digunakan dalam berbagai percobaan biokimia
dimana dibutuhkan pH yang terkontrol dan tepat (Fardiaz, 1992). Larutan buffer
bermanfaat untuk melarutkan kotoran yang masih terikut di dalam endapan enzim
tersebut sekaligus bisa mencegah enzim dari denaturasi dan kehilangan fungsi
biologisnya (Fox, 1991). Buffer dapat mempertahankan kondisi enzim presipitat
agar tidak terjadi perubahan pH dan mencegah agar enzim tidak mengalami
inaktivasi (Winarno, 1995). Buffer yang bersifat
asam memiliki pH kurang dari 7 sedangkan buffer basa memiliki pH lebih dari 7.
Buffer yang bersifat asam biasanya terbuat dari asam lemah dan basa
konjugasinya, sedangkan buffer yang bersifat basa biasanya terbuat dari basa
lemah dan asam konjugasinya.
Buffer fosfat adalah buffer
netral dengan kisaran pH 7. Buffer fosfat dapat dibuat dengan menggunakan
monosodium fosfat (NaH2PO4) dan basa konjugatnya yaitu
disodium fosfat (Na2HPO4). Meskipun buffer fosfat juga
merupakan larutan penyangga, namun kerja buffer ini tidak lebih baik dari
cairan rumen dalam mempertahankan pH. Hal ini dikarenakan adanya proses
saliviasi di dalam rumen. Saliva yang dihasilkan kelenjar ludah berperan sebagi
buffer alami bagi rumen sehingga kemampuan mempertahankan pH rumen lebih bagus
(Daintith, 2005).
Enzim nitrat reduktase adalah
enzim yang mampu mereduksi nitrat menjadi nitrit menjadi amonium NO3-→NO2-→
NH4+. Enzim ini banyak terkandung dalam jaringan pada tanaman
baru/muda dan ikut berperan dalam sintesa protein pada tanaman. Enzim amilasi
merupakan salah satu enzim yang tergolong enzim hidrolase yang bekeja sebagai
katalisi pada reaksi hidrolisis. Enzim amilase dapat memecah ikatan – iaktan
pada amilum hingga terbentuk maltosa. Ada tiga macam enzim amilase yaitu
α-amilase yang terdapat dalam saliva, dan pankreas yang disebut endoamilase;
β-amilase terutama terdapat pada tumbuhan dan dinamakan eksoamilse; α-amilase
yang terdapat dalam hati (Poejiadi, 1994).
Energi nitrat berasal dari
koenzim NaOH dan energi untuk reduksi berasal dari cahaya fotosintesa
(Trenggono,1989). Reduksi nitrat mengakibatkan pada organ lain selain daun,
aktivitas nitrat reduktase berjalan lambat karena pemasukkan nitrat terganggu
karena adanya penebalan dinding sel dan menurunnya kadar dan jumlah sitoplasmanya
(Lehninger, 1989). Enzim nitrat reduktase diperlukan dalam proses nitrat
menjadi nitrit dan enzim nitrit reduktase diperlukan dalam proses reaksi
menjadi ammonium. Reaksinya yaitu:
Nitrat reduktase
Nitrit reduktase
NO
3- NO
2- NH
3
Nitrat Nitrit
Amonium
Uji iod bertujuan untuk
membuktikan adanya polisakarida (amilum, glikogen dan dekstrin). Jika sampel
mengandung amilum akan menghasilkan warna biru, dekstrin menghasilkan warna
merah anggur, sedangkan glikogen dan sebagian pati yang terhidrolisis akan membentuk
warna merah coklat. Jika tidak mengandung amilum akan menghasilkan reaksi negatif
yaitu warna kuning (Putri dkk, 2012)
Uji benedict bertujuan untuk
mendeteksi karbohidrat yang mereduksi dalam larutan basa (mempunyai gugus
karbonil bebas). Reaksi positifnya ditandai dengan timbulnya endapan hijau,
kuning, atau merah jingga. Hidrolisis merupakan proses pemecahan senyawa
menjadi lebih sederhana. Uji ini bertujuan untuk menghidrolisis amilum agar
terpecah menjadi senyawa yang lebih sederhana (Winarno, 1997).
Tumbuhan kepel atau burahol (Stelechocarpus burahol) adalah pohon
penghasil buah
hidangan meja yang menjadi flora identitas
Daerah Istimewa Yogyakarta.
Dagingnya yang berwarna jingga dan mengandung sari buah itu memberikan aroma
seperti bunga mawar
bercampur buah sawo
pada ekskresi tubuh (seperti air seni, keringat, dan napas). Dalam pengobatan,
daging buahnya berfungsi sebagai peluruh kencing,
mencegah radang ginjal dan menyebabkan
kemandulan (sementara) pada wanita.
III. METODE
A. Alat dan Bahan
Alat – alat yang digunakan pada saat
praktikum adalah gelas beker, tabung reaksi, rak tabung reaksi, pro pipet, drop
plate, pipet tetes, tabung film, penjepit tabung reaksi, waterbath, vortex,
spektrofotometri, bunsen, gelas corong, kuvet, label, tisu, dan pemantik. Bahan
– bahan yang digunakan adalah irisan daun kepel, amilum, saliva, larutan Iod,
reagen Benedict, NaNO3, aquades, larutan SA 1%, larutan NAD 0,2%,
buffer fosfat (pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, dan pH 9).
B. Cara Kerja
1.
Hidrolisis Amilum
Amilum sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam 4 tabung
reaksi berbeda dan ditambah masing – masing saliva sebanyak 3 ml. Tabung reaksi
3 dan 4 ditambah buffer fosfat pH 6 sebanyak 3 ml. Tabung reaksi 1 dan 3
diambil dan diinkubasikan di suhu ruang (27 oC), tabung reaksi 2 dan
4 diambil dan inkubasi di waterbath dengan suhu 35 oC. Setiap 1
menit larutan diambil 1 tetes dan ditetesi di drop plate dan ditambah 1 tetes
iod sampai mendapatkan warna kuning dan waktu hidrolisis dicatat.
Setelah mendapatkan warna kuning, larutan tadi
dilanjutkan denga uji benedict. Reagen Benedict sebanyak 2 ml dimasukan ke dalam
tabung reaksi dan ditambah 5 tetes sampel, kemudian dipanaskan hingga ada
endapan merah bata.
2.
Pengaruh Suhu dan pH pada Enzim Nitrat Reduktase
Irisan daun kepel sebanyak 300 mg dimasukkan ke dalam
4 tabung reaksi berbeda dan ditambah
NaNO3 0,1 ml. Tabung reaksi 1 dan 2 ditambah buffer fosfat pH 6
sebanyak 5 ml, dan tabung reaksi 3 dan 4 ditambah aquades sebanyak 5 ml.
Setelah itu, tabung reaksi 1 dan 3 di inkubasikan pada suhu ruang (27 oC),
dan tabung reaksi 2 dan 4 diinkubasikan ke dalam waterbath dengan suhu 35 oC.
Setiap 3 menit sampel diambil sebanyak 3 tetes
dan diletakkan ke dropplate. Setelah itu ditambah larutan SA dan NAD
sebanyak 3 tetes hingga larutan menjadi warna pink dan waktunya dicatat.
3.
Penentuan pH Optimum Enzim Nitrat Reduktase
Daun kepel 300 mg yang telah diiris dimasukan ke dalam 5 tabung film
berbeda. Tabung fiim 1 ditambah buffer fosfat pH 5 sebanyak 5 ml, tabung film 2
ditambah buffer fosfat pH 6 sebanyak 5 ml, tabung film 3 ditambah buffer fosfat
pH 7 sebanyak 5 ml, tabung film 4 ditambah buffer fosfat pH 8 sebanyak 5 ml,
dan tabung film 5 ditambah buffer fosfat pH 9 sebanyak 5 ml. Tabung – tabung
tadi diinkubasikan ke suhu ruang selama 15 menit, dan larutan buffer disetiap tabung diganti sesuai pH
masing-masing. Larutan NaNO3 ditambahkan sebanyak 0,1 ml pada masing-masing
tabung dan digojog lalu didiamkan selama 30 menit. Kemudian, larutan sebanyak
0,4 ml dari masing-masing tabung film dimasukkan kedalam tabung reaksi yang
berbeda. Reagen SA dan NED masing-masing sebanyak 0,3 ml ditambahkan kedalam
masing-masing tabung reaksi dan larutan aquadest sebanyak 6 ml ditambahkan
kedalam masing-masing tabung reaksi. Larutan divortex dan kadar OD diukur
dengan menggunakan spektrofotometer dengan l = 540 nm. Kadar ANR lalu
dihitung dengan menggunakan rumus :
ANR=
x
x
x
x
(
m mol/gr/jam)
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan percobaan yang
dilakukan, hasil yang didapat adalah:
Tabel 1. Hasil
Uji Pengaruh pH dan Suhu terhadap kemampuan Hidrolisis Amilum oleh Enzim
Amilase
Tabung
|
Perlakuan
|
Waktu
|
Warna Akhir Uji
Iod
|
Warna akhir uji
Benedict
|
Keterangan
|
1
|
Saliva (suhu ruang)
|
1 menit
|
Kuning
|
Endapan merah bata
|
++
|
2
|
Saliva (waterbath)
|
1 menit
|
Kuning
|
Endapan merah bata
|
+++
|
3
|
saliva + buffer fosfat pH 6 (suhu ruang)
|
1 menit
|
Kuning
|
Endapan merah bata
|
+
|
4
|
Saliva + buffer fosfat pH 6 (waterbath)
|
1 menit
|
Kuning
|
Endapan merah bata
|
++++
|
Keterangan : + = ada endapan; - =
tidak ada endapan
Pembahasan
Percobaan ini termasuk uji
kualitatif dengan tujuan untuk melihat pengaruh pH dalam hidrolisis amilum oleh
enzim amilase. Hidrolisis
merupakan proses pemecahan senyawa menjadi lebih sederhana. Percobaan ini
bertujuan untuk melihat kerja enzim amilase dalam memecah amilum menjadi
karbohidrat yang lebih sederhana (monosakarida / oligosakarida) yang ditandai
dengan perubahan warna larutan dan terbentuknya endapan. Amilase yang terdapat
pada saliva dapat mengubah/memecah amilum menjadi gula yang lebih sederhana. Pada
praktikum ini menggunakan saliva dan amilum. Penggunaan saliva bertujuan untuk
sebagai penyedia enzim amilase dan amilum berfungsi sebagai substrat untuk
enzim amilase. Amilase
mengikat sisi aktif pada amilum sehingga akan membentuk kompleks enzim-substrat
dan mengubahnya menjadi karbohidrat – karbohidrat
yang lebih sederhana (produk).
Setiap larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan
diinkubasikan di suhu ruang dan waterbath. Dilakukan inkubasi dengan tujuan
untuk membandingkan pada suhu berapa enzim itu akan bekerja secara optimal,
dalam suhu ruang atau pada suhu 35 oC yang dilakukan pada waterbath.
Larutan juga ditambah dengan buffer fosfat pH 6 dengan tujuan untuk mendapatkan
pH optimum karena enzim amilase yang terdapat dalam saliva mampu menghidrolisis
ikatan α-1 antar D-glukosa dalam amilum pada pH optimum, yaitu pH 6. Ada
beberapa uji yang dilakukan pada hidrolisis amilum yaitu uji Iod dan uji
Benedict. Uji iod bertujuan untuk menghidrolisis amilum agar amilum pada enzim
habis terhidrolisis dan reaksi positifnya menghasilkan warna biru, dan reaksi
negatifnya menghasilkan warna kuning. Uji benedict dilakukan ketika uji iod
telah mendapatkan hasil akhir warna kuning. Uji benedict bertujuan untuk
membuktikan bahwa amilum telah terhidrolisis dan mengandung gula pereduksi
seperti glukosa yang ditandai dengan reaksi posotif yaitu terbentuknya endapan
merah bata. Reagen benedict adalah adalah larutan pereaksi yang mengandung
kuprisulfat, natrium karbonat dan natrium sitrat. Gula pereduksi adalah gula
yang dapat mereduksi ion-ion kupri (Cu2+) menjadi bentuk kupro (Cu+)
yang ditandai dengan terbentuknya endapan (CuO2). Pemanasan
berfungsi untuk membuat hidrolisis amilum berlangsung lebih cepat karena
semakin tinggi suhu semakin akan mengakibatkan aktivitas pada enzim berlangsung
dengan cepat.
Berdasarkan percobaan yang dilakukan, hasil pada tabel 1
adalah: pada tabung 1 saliva diinkubasikan di suhu ruang dengan warna akhir uji
iod kuning dan warna akhir uji benedict biru ada endapan merah bata. Pada tabung
2 saliva diinkubasikan di waterbath dengan warna akhir uji iod kuning dan warna
akhir uji benedict biru ada endapan merah bata. Pada tabung 3 saliva ditambah
buffer fosfat pH 6 diinkubasikan pada suhu ruang dengan warna akhir uji iod
kuning dan warna akhir uji benedict biru ada endapan merah bata. Pada tabung 4
saliva ditambah buffer fosfat pH 6 diinkubasikan di waterbath dengan warna
akhir uji iod kuning dan warna akhir uji benedict biru ada endapan merah bata.
Waktu yang dibutuhkan pada uji iod di setiap perlakuan adalah 1 menit dan
endapan paling banyak di uji benedict adalah pada tabung 4, tabung 2, tabung 1,
dan tabung 3. Dari hasil yang didapat amilum terhidrolisis oleh enzim secara
optimal dalam waktu yang sama baik itu inkubasi waterbath maupun suhu ruang.
Hal ini membuktikan bahwa enzim dapat menghidrolisis amilum pada suhu tubuh dan
suhu ruang dalam waktu hanya 1 menit
Tabel 2.
Hasil Uji Pengaruh pH dan Suhu terhadap Kemampuan Reduksi Nitrat oleh Enzim
Nitrat Reduktase
Tabung
|
Perlakuan
|
Waktu
|
Warna Akhir
|
Keterangan
|
1
|
Daun kepel + buffer fosfat pH 6 (suhu ruang)
|
15 menit
|
Kuning Bening
|
-
|
2
|
Daun kepel + buffer fosfat pH 6 (waterbath)
|
3 menit
|
Pink
|
+
|
3
|
Daun kepel + aquades (suhu ruang)
|
3 menit
|
Pink Muda
|
+
|
4
|
Daun kepel + aquades (waterbath)
|
9 menit
|
Kuning
|
-
|
Pemabahasan
Percobaan ini termasuk uji
kualitatif dengan tujuan untuk melihat lamanya waktu serta kerja enzim nitrat
reduktase yang terdapat dalam irisan dan kepel. Percobaan ini menggunakan
irisan daun kepel dan larutan NaNO3 sebagai sampel. Irisan daun
kepel berfungsi sebagai pemberi enzim nitrat reduktase dan larutan NaNO3
dengan ion nitrat (NO3-) yang berfungsi sebagai substrat
enzim nitrat reduktase. Nitrat
reduktase akan mengikat sisi aktif pada nitrat sehingga akan membentuk kompleks
enzim-substrat dan mengubahnya menjadi
nitrit (NO2-) dan akhirnya menjadi amonium (NH3)
sebagai produk akhir. Reaksi yang
terjadi yaitu
Nitrat reduktase
Nitrit reduktase
NO
3- NO
2- NH
3
Nitrat
Nitrit Amonium
Irisan daun kepel dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan
ditambah larutan NaNO3, kemudian diinkubasikan di suhu ruang dan di
waterbath. Diinkubasikan
pada suhu ruang berfungsi untuk enzim nitrat reduktase ion nitratnya berubah
menjadi nitrit pada waktu yang berbeda dan perlakuan yang berbeda. Penambahan
buffer fosfat pH 6 pada larutan berfungsi untuk mendapatkan pH optimum yaitu pH
6 karena enzim nitrat reduktase memiliki pH optimal di antara pH 6 – 7 sehingga
dapat bekerja dengan baik pada pH ini. Perlakuan enzim dengan buffer fosfat
menunjukkan bahwa enzim akan bekerja dengan kecepatan reaksi paling tinggi pada
daerah pH tertentu. Penambahan aquades pada larutan menunjukkan tidak adanya
penyangga dalam larutan sehingga enzim tidak bekerja pada pH optimumnya dan
memiliki kecepatan reaksi lebih lama atau penyedia suasana netral pada larutan.
Larutan
yang diinkubasikan tadi setiap 3 menit diambil 3 tetes diletakkan pada drop
plate dan ditambahkan larutan SA dan NED secara berutan sebanyak 3 tetes.
Penambahan SA dan NED pada larutan berfungsi untuk mengetahui terjadinya proses
reduksi nitrat yang ditandai dengan perubahan warna larutan menjadi pink.
Perubahan warna menjadi pink menunjukkan bahwa nitrat telah tereduksi semuanya
atau nitrat telah habis bereaksi.
Berdasarkan
tabel 2 hasil yang didapat adalah pada tabung 1 daun kepel ditambah buffer
fosfat pH 6 diinkubasikan pada suhu ruang dengan waktu 15 menit dan warna akhir
kuning bening. Pada tabung 2 daun kepel ditambah buffer fosfat pH 6
diinkubasikan pada water bath dengan waktu 3 menit dan warna akhir pink. Pada tabung
3 daun kepel ditambah aqaudes diinkubasikan pada suhu ruang dengan waktu 3
menit dan warna akhir pink. Pada tabung 4 daun kepel aqaudes diinkubasikan pada
waterbath dengan waktu 9 menit dan warna akhir kuning bening. Dari hasil yang
tabung 1 diinkubasikan ke suhu ruang dan tabung 4 diinkubasikan pada waterbath
membutuhkan waktu yang lebih lama kepel untuk berubah menjadi warna pink
dibandingkan dnegan tabung 2 dan tabung 3 karena buffer fosfat pH 6 menghambat
kerja enzim reduktase dan kurangnya waktu untuk enzim nitrat reduktase
mereduksi nitrat.
Tabel 3. Hasil Uji Penentuan pH
optimum Enzim Nitrat Reduktase
Tabung
|
pH
|
OD (Optical
Density)
|
ANR
|
1
|
5
|
0,081 Ǻ
|
475,35
|
2
|
6
|
0,083 Ǻ
|
487,09
|
3
|
7
|
0,089 Ǻ
|
522,30
|
4
|
8
|
0,083 Ǻ
|
487,09
|
5
|
9
|
0,087 Ǻ
|
510,56
|
Pembahasan
Percobaan ini merupakan uji
kuantitatif dengan tujuan mengetahui
pH optimum suatu enzim. Setiap enzim memiliki pH optimal yang berbeda-beda.
Pada pH optimumnya, enzim dapat bekerja pada tingkat optimalnya yaitu pada pH
7. Adanya pengendalian pH merupakan suatu cara penting untuk mengatur aktivitas
enzim. Pada pengujian ini menggunakan tabung film yang berfungsi untuk mencegah
cahaya matahari masuk yang bisa mereduksi nitrat menjadi ammonia bukan menjadi
nitrit. Daun kepel yang dimasukkan ke dalam tabung film ditambah buffer fosfat
dengan pH yang berbeda – beda yaitu pH 5, 6, 7, 8, dan 9. Penambahan buffer
fosfat dengan berbagai pH berfungsi untuk menunjukkan bahwa enzim akan bekerja
dengan kecepatan reaksi paling tinggi pada daerah pH optimumnya. Kemudian tabung
film diinkubasikan di suhu ruang selama 15 menit. Setelah itu, larutan bauffer
pada masing – masing tabung film diganti dengan buffer sesuai dengan pH larutan
buffer.
Penggantian buffer berfungsi untuk unsur-unsur kontaminan
pada daun kepel dapat dihilangkan. Setelah penggantian tabung film ditambah
NaNO3, digojog agar larutan tercampur dan didiamkan selama 30 menit
yang bertujuan agar larutan NaNO3 dapat bereaksi dengan sempurna
dengan masing-masing buffer. Larutan tadi diambil dan ditambah dengan larutan
SA dan NED secara berurutan dengan tujuan untuk memberikan warna pada larutan
(merah) supaya absorbansinya (OD) dapat diukur. Penambahan aquades untuk
mengencerkan larutan supaya larutan tidak terlalu pekat pada saat di
spektrofotometri. Larutan di absorbansi dengan panjang gelombang 540 nm karena
panjang gelombang yang efektif untuk mengabsorbansi sampel yang berwara hijau. Absorbansi
menunjukkan kemampuan menyerap cahaya suatu zat. Semakin pekat warna suatu zat,
semakin banyak zat yang terkandung di dalamnya dan semakin tinggi pula nilai
absorbansinya.
Berdasarkan
tabel 3 hasil yang didapat adalah pada tabung 1 dengan pH 5 mendapatkan OD
0,081 Ǻ dan ANR
475,35 μ mol/gr/jam; pada tabung 2
dengan pH 6 mendapatkan OD 0,083 Ǻ
dan ANR 487,09 μ mol/gr/jam; pada tabung 3
dengan pH 7 mendapatkan OD 0,089 Ǻ
dan ANR 522,30 μ mol/gr/jam; pada tabung 4
dengan pH 8 mendapatkan OD 0,083 Ǻ
dan ANR 487,09 μ mol/gr/jam; dan pada
tabung 5 dengan pH 9 mendapatkan OD 0,087 Ǻ dan ANR 510,56 μ mol/gr/jam. Dari hasil yang didapat pH 7
memiliki nilai ANR terringgi. Hal ini berarti pada pH 7 nitrat
makin banyak tereduksi, inilah juga enzim reduktase bekerja secara optimal
mereduksi nitrat. Aktivitas enzim nitrat reduktase akan optimal yaitu kecepatan
reaksinya besar sehingga reaksi berlangsung cepat dan menghasilkan produk yang
lebih besar.
V. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil percobaan, diambil
kesimpulan sebagai berikut:
1.
Waktu yang dibutuhkan untuk hidrolisa amilum
pada enzim amilase dari saliva adalah 1 menit dan pada perlakuan diinkubasi
diwaterbath dengan suhu 35 oC dan suhu ruang 27 oC.
2.
Pada pengujian
pengaruh pH dan suhu pada reduksi nitrat oleh enzim nitrat reduktase didapat
hasil akhir tabung 1 bening kekuningan dengan waktu 15 menit, tabung 2 pink dengan
waktu 3 menit, tabung 3 warna akhir pink dalam waktu 3 menit, tabung 4 warna
akhir kuning bening dalam waktu 9 menit.
3.
Pada uji penetuan pH optimum enzim nitrat
reduktase pada pH 1 dengan OD 0,081 Ǻ dan ANR 475,35; pada
pH 2 dengan OD 0,083 Ǻ dan ANR 487,095; pada pH 3
dengan OD 0,089 Ǻ dan ANR 522,30; pada pH 4
dengan OD 0,083 Ǻ dan ANR 487,09; dan pada pH 5
dengan OD 0,087 Ǻ dan ANR 510,56;
DAFTAR PUSTAKA
Aryulina, D., Muslim,
C., Manaf, S., dan Winarni, E. W. 2007. Biologi
3. Esis, Jakarta.
Daintith, J.
2008. Kamus Lengkap Kimia.
Erlangga, Jakarta.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi
Pangan 1. Gramedia Pustaka, Jakarta.
Fox, P.F. 1991. Food
Enzymology Volume 2. Elsevier Applied Science, London.
Gaman, P.M., dan Sherrington, K. B. 1994. Ilmu Pangan, Pengantar Ilmu Pangan, Nutrisi
dan Mikrobiologi. Universitas Gadjah Mada – Press, Yogyakarta.
Lehninger, L.A. 1990. Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga, Jakarta.
Montgomery, R. 1993. Biokimia Suatu Pendekatan Berorientasi Kasus.
UGM-Press, Yogyakarta.
Plamer. 1979. An Introduction to Practical Biochemistry.
McGraw-Hill, New Delhi.
Poedjiadi,
A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. UI –
Press, Jakarta.
Putri, W. D., Haryadi, Marseno, D. W., dan Cahyanto, M.
N. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Amilolitik Selama
Fermentasi Growol Makanan Tradisional Indonesia. Jurnal Teknologi Pertanian 13(1): 52 – 60.
Sumardjo,
D. 2009. Pengantar Kimia: Buku Panduan
Kuliah Mahasiswa Kedokteran dan Program Strata 1 Fakultas Bioeksakta. Penerbit
Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Tranggono dan Sutardi. 1990. Biokimia dan Teknologi Pasca Panen. Gajah Mada University – Press,
Yogyakarta.
Trenggono. 1989. Biokimia Pangan. UGM – Press,
Yogyakarta.
Widmann, F. K. 1992. Tinjauan Klinis Atas Hasil Pemeriksaan
Laboratorium. Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Winarno, F. G. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Gramedia Pustaka
Utama, Jakarta.
Wirahadikusuma. 1989. Biokimia Protein dan Asam Nukleat.
Penerbit ITB, Bandung.
LAMPIRAN
A. Perhitungan
ANR
ANR =
x
x
x
x
(μmol NO
2-/gram/jam)
= 475,35 μ
mol/gr/jam
= 487,09 μ
mol/gr/jam
= 522,30 μ
mol/gr/jam
= 487,09 μ
mol/gr/jam
= 510,56 μ
mol/gr/jam
Keterangan:
Absorbansi
standar: 0,0142
W= 300
mg = 0,3 g
Vm
(volume medium)= 5 ml
Va
(Volume Alikuot)= 0,4 ml
T= 0,5
jam
B. Grafik ANR
